1.  引言

環(huán)孢素A (Cyclosporine A, CyA)是一種由11個(gè)氨基酸組成的親脂性環(huán)狀多肽，在臨床上被用作一種有效的免疫抑制劑，用于預(yù)防各種organ 移植中的同種異體移植排斥反應(yīng)，以及治療全身和局部自身免疫性疾病。盡管 CyA 具有巨大的治療價(jià)值，但其最初的油基口服制劑(Sandimmune®)由于分子量高、剛性環(huán)結(jié)構(gòu)和水溶性差，表現(xiàn)出較高的個(gè)體變異性和較差的生物利用度。

p-糖蛋白介導(dǎo)排出腸細(xì)胞、廣泛全身代謝前腸壁和肝臟，進(jìn)一步降低了CyA的口服生物利用度。目前臨床上可用的 CyA 商業(yè)產(chǎn)品是以微乳為基礎(chǔ)的預(yù)濃縮制劑(Sandiummune Neole®)，該制劑顯示出相對(duì)較高的治療口服生物利用度，且變異性較小。

盡管 Neoral 取得了成功，但 CyA 在口服給藥領(lǐng)域一直受到關(guān)注，主要是因?yàn)槠渌苄詷O差，滲透性差，而這正式測(cè)試口服給藥系統(tǒng)效率具挑戰(zhàn)性的模型藥物之一。在過(guò)去的十年中，人們研究了各種納米級(jí)藥物遞送系統(tǒng)來(lái)提高 CyA 的口服生物利用度。在這些載體中，脂質(zhì)體因其促進(jìn)吸收的能力和良好的生物相容性而具有廣闊的應(yīng)用前景。由磷脂酰膽堿（SPC）和膽固醇 (CHOL) 組成的傳統(tǒng)脂質(zhì)體制劑的口服生物利用度與 Sandimmune Neoral 相似。

在 Guan 等人之前的研究中，含有膽鹽脫氧膽酸鈉（SDC）的脂質(zhì)體被證實(shí)可以將難溶藥物非諾貝特的口服生物利用度提高5.13倍，此次制備了含有膽鹽脫氧膽酸鈉的CyA脂質(zhì)體，并在體外和體內(nèi)進(jìn)行了評(píng)價(jià)，目的是提高CyA的口服生物利用度。

2.  SPC/SDC脂質(zhì)體制備

取圓底燒瓶，將SPC、SDC和CyA溶解于二氯甲烷/乙醇（9/1, V/V）溶液中，通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在30℃水浴去除有機(jī)溶劑。干燥的脂膜在真空中保持2小時(shí)，以去除微量的溶劑。然后在40℃下通過(guò)磷酸緩沖溶液（50 mM, pH7.4）進(jìn)行復(fù)溶30分鐘，得到脂質(zhì)體粗分散體。 

然后進(jìn)行高壓均質(zhì)，得到粒徑更小的脂質(zhì)體。脂質(zhì)體在4℃下保存至使用。對(duì)于SPC/Chol脂質(zhì)體的制備，其步驟類似，使用Chol 替換SDC。

在不同均質(zhì)參數(shù)、配方變量（SPC/SDC 的比例、SPC 的濃度和 CyA 負(fù)載量）下制備了不同脂質(zhì)體并進(jìn)行了相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)：

① 使用不同的均質(zhì)壓力（50,100,150,200bar），不同的均質(zhì)次數(shù)（5,10,15,20,25次）制備脂質(zhì)體，測(cè)量不同均質(zhì)參數(shù)下 CyA 脂質(zhì)體的顆粒大小。

② 使用不同的SPC/SDC 的比例（3/1、4/1、5/1、6/1、9/1）、不同的SPC 的濃度（1%、2%、3%、4%、5%、6%）和 不同的 CyA 負(fù)載量（0.8、1.2、1.6、2、2.4 mg/mL）制備脂質(zhì)體，測(cè)量不同濃度配比下 CyA 脂質(zhì)體的顆粒大小。

4.  結(jié)果-均質(zhì)參數(shù)對(duì)粒徑的影響

我們研究了幾個(gè)因素對(duì)脂質(zhì)體顆粒大小和分布的影響。如圖 1A 和圖 1C 所示， SPC/SDC 脂質(zhì)體在均質(zhì)前通常為 1 μm大小，并表現(xiàn)出較寬的尺寸分布。均質(zhì)后脂質(zhì)體的粒徑和多分散性指數(shù)(PI)顯著減小，當(dāng)均質(zhì)壓力增加到 100bar 時(shí)，脂質(zhì)體的直徑最小(約80 nm)(圖1B，1C)。

圖1均質(zhì)參數(shù)對(duì)環(huán)磷酰胺SPC/SDC脂質(zhì)體粒徑和 PI（多分散系數(shù)）的影響。縮寫：Chol，膽固醇；CyA，環(huán)孢素A；PI，多分散指數(shù)；SPC，大豆磷脂酰膽堿；SDC，脫氧膽酸鈉。

(A)和(B)顯示了均質(zhì)前后載 CyA 的SPC/SDC脂質(zhì)體的尺寸分布。粒徑和 PI 與不同因素，包括均質(zhì)壓力（P＜0.01 比較 100 和 150 bar 的 PI；P＜0.001 比較 100 和 150 bar 的 PI）（C）和均質(zhì)次數(shù)（D）顯示。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n=3)表示。

然而，當(dāng)均質(zhì)壓力進(jìn)一步增加到 200bar 時(shí)，顆粒尺寸和 PI（多分散系數(shù)）顯著增加(P<0.01)。這一現(xiàn)象可以用均質(zhì)大剪切力作用下囊泡的破裂和聚集來(lái)解釋。此外，在 100bar 的均質(zhì)壓力下均質(zhì)次數(shù)大于 5 次，顆粒大小沒(méi)有明顯變化(P＞0.05)(圖1D)。然而，當(dāng)均質(zhì)次數(shù)增加到 20 次時(shí)，PI （多分散系數(shù)）低，25次均質(zhì)后可能發(fā)生破裂和聚集，導(dǎo)致 PI 增加(圖1D)。因此，我們選擇了100bar或200bar的均質(zhì)壓力來(lái)制備 SPC/SDC 脂質(zhì)體，用于后續(xù)的研究。 

為了獲得與 SPC/SDC 脂質(zhì)體相近的平均粒徑，選擇 300bar 均質(zhì)20次來(lái)均質(zhì) SPC/Chol 脂質(zhì)體，但其柔韌性較差。此外，微米級(jí)的脂質(zhì)體常為多層結(jié)構(gòu)，通常通過(guò)薄膜分散法制備而得。進(jìn)一步的均質(zhì)可能會(huì)產(chǎn)生單層脂質(zhì)體。 

5.  結(jié)果-配方變量對(duì)粒徑的影響

SPC/SDC 的比例、SPC 的濃度和 CyA 負(fù)載量也對(duì)粒徑和分布有顯著影響。在 SPC/SDC 比率為 3/1 時(shí)，粒徑約為80 nm, PI為0.1。SPC/SDC比率從3/1增加到4/1（P＞0.05，圖2A）時(shí)，雙層結(jié)構(gòu)的粒徑?jīng)]有顯著變化。相反的是，繼續(xù)增加SPC/SDC含量至6/1或9/1，粒徑和PI值顯著增加（圖2A）。

圖2 配方變量對(duì)CyA-SPC/SDC脂質(zhì)體粒徑和 PI（多分散系數(shù)）的影響。縮寫：CHOL，膽固醇；CyA，環(huán)孢素A；PI，多分散指數(shù)；SPC，大豆磷脂酰膽堿；SDC，脫氧膽酸鈉。SPC/SDC(A)的比例(***P＜0.001，比較兩組的顆粒大小；***P＜0.001，以3/1和4/1的比例比較PI)；SPC(B)的濃度(**P＜0.01，比較兩組的顆粒大小；P＜0.05，比較兩組的PI)；CyA載量(C)(**P＜0.01，比較兩組的顆粒大小；P＜0.001比較兩組的PI)。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n=3)表示。 

脂質(zhì)雙分子層的粒徑和 PI 值隨著 SDC 含量的減小而減小可能是由于囊泡的柔韌性增加和表面張力降低所致。通過(guò) DHA/SDC 二元混合物制備，增加 SDC 含量，會(huì)降低得到懸浮液的粒徑。

進(jìn)一步研究了 SPC 濃度對(duì)顆粒大小和PI的影響，結(jié)果表明，將 SPC 的重量比提高到 4% (P＞0.05)，對(duì)顆粒大小和 PI 沒(méi)有顯著影響。)(圖2B)。然而，當(dāng) SPC 的重量比達(dá)到 6% 時(shí)，脂質(zhì)體略有增大，PI 增加，這可能是由于 SPC 濃度升高導(dǎo)致粘度增加(圖2B)。

當(dāng) CyA 濃度低于 2 mg/mL時(shí)，載藥量對(duì)顆粒大小和PI無(wú)顯著影響(P＞0.05)。然而，當(dāng) CyA 負(fù)載為 2.4 mg/mL時(shí)，顆粒大小和 PI 顯著增加(圖2C)。可能是未包封藥物的再結(jié)晶和表面張力的顯著增加。

6.  TEM結(jié)果

圖 3 顯示了裝載 CyA 的 SPC/SDC 脂質(zhì)體的 TEM 照片。載有 CyA 的 SPC/SDC 脂質(zhì)體的粒徑約為 90 nm，這與通過(guò)粒徑測(cè)量獲得的結(jié)果具有良好的相關(guān)性。

圖 3 載有 CyA 的 SPC/SDC 脂質(zhì)體的 TEM 形態(tài)。縮寫：CyA，環(huán)孢素A；SPC，大豆磷脂酰膽堿；SDC，脫氧膽酸鈉。

7.  結(jié)論

在研發(fā)脂質(zhì)體遞送提高藥物生物利用率過(guò)程中，Nicomp 3000 能穩(wěn)定且快速對(duì)脂質(zhì)體顆粒大小、顆粒分布、Zeta電位進(jìn)行表征，此外還可搭配PSI微射流均質(zhì)機(jī)、AccuSizer顆粒計(jì)數(shù)器、德國(guó)LUM穩(wěn)定性分析儀，為脂質(zhì)體的研發(fā)、生產(chǎn)和質(zhì)量控制提供整套解決方案。 

參考資料

[1] Peipei Guan,Yi Lu,Jianping Qi,Mengmeng Niu,Ruyue Lian,Fuqiang Hu,Wei Wu,Enhanced oral bioavailability of cyclosporine A by liposomes containing a bile salt